用 PBS 或碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀釋抗原到 PVC 微孔板上，按要求往后進行系列稀釋。

通常將未知濃度樣品與陽性對照標準曲線相比較，可精確定量。每塊板都要帶標準（做平行或者三份）和空白對照以保證精確性。

用鼠抗體對鼠組織染色是個復雜的過程，因為容易導致背景染色高，而且很難消除。 形成這種背景主要是由于組織染色時二抗與內源性的鼠 IgG，或 B 細胞、漿細胞及巨噬細胞上的 Fc 受體結合造成的。

出于多種考慮，將小組織片段簡單浸泡在固定液中便能得到合適的固定，對大多數組織來說可能是唯一的固定模式。然而更快、更均一的固 定方法是將固定液通過管道系統如心主動脈或腹部主動脈灌注到組織中。下面介紹一下用 4% 多聚甲醛固定大鼠大多數器官的操作步驟。

固定就是保持抗原細胞和亞細胞結構固定不動，同時又能使抗體進入到細胞和亞細胞的所有部位。固定和通透方法的選擇取決于抗原表位和 抗體本身的靈敏性，有時需要優化。

關于免疫組織化學內容，今天要介紹的是冷凍切片切割技術和免疫細胞化學 (ICC) 指南的具體步驟。

免疫組織化學 (IHC) 是確定組織切片上蛋白的存在與否及存在位置的一種方法。盡管這種方法在定量分析時靈敏度較免疫印跡法或 ELISA 等 免疫測定方法低，但是它能觀察到整個組織的情況。適用于評估癌癥等疾病的發展及治療情況。

無信號:一抗和二抗不匹配,二抗需和一抗宿主的物種相同（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）。沒有足夠的一抗或二抗結合目標蛋白

蛋白顯色的階段非常重要，可以知道蛋白遷移的是否均勻、平坦。如果分離后的蛋白需要轉膜，就用銅染，因為考馬斯藍染色是不可逆的。 考馬斯藍染色只用來檢測轉移的有效性，或者蛋白不需要轉膜時，只用于觀測蛋白 SDS-PAGE 分離的結果。

電泳可以是單相的（即一維分離）也可以是雙相的。單相電泳常用來進行蛋白和核酸的分離，蛋白的雙相電泳用于指紋-識別（即總蛋白成分分析）和細胞里所有蛋白的精確定位。這里我們所描述的是單相電泳技術。

準備凝膠電泳的樣品，需要對細胞和組織進行裂解以釋放目的蛋白，這些可溶性蛋白能夠穿過分離膠單獨移動。裂解緩沖液有很多種，但用 來做 WB試驗的僅有少數幾種。簡單來說，它們溶解蛋白的能力不同，含有十二烷基硫酸鈉和其他離子型去污劑的溶解能力最強。

由于其獨特的電子構型，熒光物具有典型的吸收（激發）和發射光譜。

單一染色在特定波長被激發，在另外一個波長發射光子。

復合染色由距離非常近的、能量可以在彼此之間傳遞的一個供體及一個受體熒光物分子所組成。復合染色在受體分子的激發波長

被激發，在 供體分子的發射波長發射一個光子