Western Blot條帶灰度分析：Image J和Graphpad運用

蛋白表達分析我們可以從蛋白表達與否？表達多少？目的蛋白在哪里表達來分析？而分析蛋白的方法有很多種，其中Western blot（WB，蛋白免疫印跡）就是大家所熟知得方法，WB是研究蛋白表達的一個經典方法。對于一些時間點或者是不同組織蛋白表達量的分析就涉及到量的變化。一些凝膠成像軟件帶有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系統專用軟件。除了這些軟件，還有一個比較簡單的綜合性質圖像處理軟件Image J可以很方便的進行灰度分析。而且Image J是開源性質的免費軟件，可以在其官網直接下載使用。

對Western Blot條帶進行數值化有兩種方法——灰度分析和光密度分析?；叶仁怯嬎銠C圖像分析儀根據圖像顏色深淺分為256個級別?；叶戎翟叫∥矬w顏色越深。光密度是指光線通過溶液或某一物質前的入射光強度IO與該光線通過溶液或物質后的透射光強度Ib比值的對數OD=log（IO/Ib）；圖像分析中，入射光和透射光強度分別被切片上最亮區域的平均灰度值和待測目標平均灰度值取代，則圖像分析系統的光密度值=log（切片標本最亮區域的平均灰度值（g0）/待測目標的平均灰度值（g））。光密度值越大，物體顏色越深，陽性物質相對含量越大。

對于灰度值來說，切片標本制作時染色時間長短，以及測量時顯微鏡照明光源電壓的大小對其影響很大。而光密度是一個比值。是通過計算一張切片標本最亮區域的平均灰度值與該切片標本中待測目標的平均灰度值的比值，再根據數學公式計算而來的，所以受切片標本染色時間長短及照明光源電壓關系很小。

然而有研究實踐顯示，灰度值與光密度值二者之間存在著線性關系，都可以用來進行WB定量分析。

 同樣，Image J軟件進行WB條帶定量分析時也存在兩種方法，此處只列舉一種方法，具體步驟如下。

1、下載安裝，并打開Image J軟件。

2、導入WB條帶圖片。File→Open→ 彈出對話框→選擇文件夾→找到WB條帶。

3、把圖片轉化成灰度圖片：Image→Type→8-bit。這時WB圖片將會隨之改變。

4、消除圖片背景的影響。Process→Subtract Background。在彈出的對話框中，填上50基本就可以了，也可以稍高些，并勾上Light background，點擊OK即可。此時圖片背景會變白一些。

5、設置定量參數。Analyze→Set Measurements。在彈出的對話框中勾選Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density。

6、設置單位。Analyze→Set Scale。在彈出的對話框“Unit of length”后面填上“pixels”，其他的不用改動。

7、把WB圖片轉換成亮帶。Edit → Invert。

8、選擇菜單欄下的一系列不規則圓圈，根據情況選擇一種。然后將圓圈手動拉倒第一條帶，并盡量將條帶都圈起來。

9、點擊菜單欄Analyze下拉出現的measurement，即可彈出你選定區域的灰度統計值。也可以點擊快捷鍵（英文狀態下的鍵盤m）。

10、手動移動不規則圓圈至下一條條帶，重復8、9步驟，直至所有條帶都被測量。

11、當測定完所有條帶，選結果中的“Edit”的“Select All”，然后復制數據“IntDen”到Excel表即可進行分析。也可以直接在Results對話框中，選擇File → Save as，直接導出excel表格。

 

12、在excel表格中將目的蛋白的灰度值除以內參蛋白的灰度值，進行歸一化處理。

13、下載安裝，并打開Graphpad軟件。

14、在對話框左側欄目“New table & graph”下選擇“Column”。然后再右側選擇所要作的圖形，以及是否顯示誤差棒等，具體如下圖。

15、在彈出的表格中，填上excel中的比值。

16、然后點擊菜單欄上Insert → New Graph of Existing Data... 。也可以在工具欄Sheet中的“New”條目下找到。（其實這步可以省略）

17、在彈出的對話框“Create New Graph”中，填寫新圖名稱，選擇分析方法，圖形，以及誤差棒的表示方法，具體如下。（其實這步可以省略）

18、此時，可以在工具欄下左側的狀態欄“Graphs”文件夾中找到所建新圖“Date 1”。

                               

19、此時可以對圖形的外觀進行修改，增加圖片題目以及XY軸名稱。直接在圖上對應位置左鍵點擊修改。

20、也可以借助工具欄“Change”中的功能鍵對圖片的柱形圖顏色、寬度、高度、間隔等進行調整。

21、然后點擊工具欄“Export”將新建的柱形圖導出。

22、上面只是單因素的柱狀圖構建方法。如果是雙因素，應該在一開始選擇“Column”時選擇“Grouped”。切記??！