文獻解讀｜慢性病毒感染期間，CD8+ T細胞可誘導惡病質

 

      研究背景：

 

       慢性疾病如感染和惡性腫瘤患者常面臨惡病質，這是一種多因素綜合征，可加重潛在疾病并惡化預后。惡病質表現為行為癥狀和代謝癥狀，其嚴重程度因疾病和個體而異，難以定義和診斷。惡病質患者表現為厭食癥、快感缺乏癥和嗜睡，以及體重意外下降5%以上。這是由脂肪和瘦肉塊的迅速消耗引起的，這不僅影響患者的生活質量，而且往往是發病率和死亡率的主要原因。傳統的營養支持不能逆轉惡病質。雖然已經探索了幾種治療方案，如生食欲激素促生成素激動劑，但預防或減輕惡病質的護理標準仍不明確。

 

      惡病質的出現伴隨著大量的促炎細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN) -γ,白介素(IL) 6和IL-17 。根據疾病模型，這些細胞因子可由腫瘤細胞分泌，如癌癥、宿主免疫細胞和/或參與代謝調節的細胞，如脂肪細胞。癌癥相關惡病質(CAC)小鼠模型極大地提高了我們對體重減輕機制的理解。然而，適當的機制模型研究惡病質的背景下感染仍不發達。在本研究中，我們使用了慢性病毒感染的小鼠基準模型來探討感染相關惡病質(IAC)的分子和細胞需求。我們設計了一種遺傳、飲食和藥理學干擾的綜合方法來揭示CAC和IAC的共同和獨特特性。這導致了脂肪組織形態學、分子和代謝變化的表征，并確定了IAC的主要免疫驅動因素，為惡病質的病理生理學提供了急需的分子研究。

 

      研究目的：

 

      惡病質是各種癌癥、慢性炎癥和感染的主要發病和死亡原因。對惡病質發生機制的了解仍然有限，尤其是對感染相關性惡病質(IAC)。本文描述了一種慢性病毒感染小鼠可逆性惡病質模型，并確定了CD8+ T細胞在IAC中的重要作用。與癌癥相關惡病質相關的細胞因子與IAC無關。相反，病毒特異性CD8+ T細胞引起脂肪組織的形態學和分子變化，導致脂質儲存的枯竭。這些變化發生在CD8+ T細胞反應峰值之前的時間點，需要T細胞固有的I型干擾素信號和抗原特異性啟動。我們的研究結果將全身抗病毒免疫反應與脂肪組織重塑聯系起來，揭示了CD8+ T細胞在IAC中的作用被低估。

 

      材料方法

 

       1.實驗材料：C57BL/6野生型和基因突變型小鼠模型，(2 ×106 FFU) LCMV strain clone 1病毒

 

       2.實驗方法：小鼠熱量測定，灌喂實驗，抗體和藥物治療，EchoMRI-100H (EchoMRI LCC)成像技術，病理實驗（HE染色，IF)，血清檢測，ELISA實驗(KET0004, Abbkine)，RT-PCR，流式細胞術，RNA-seq等。

 

      實驗結果：

 

      感染LCMV克隆13可導致可逆性惡病質。野生型C57BL/6J小鼠感染淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)慢性株克隆2 106個焦點形成單元(FFU)，感染后第一周體重下降15 20%(圖1a)。為了評估這是惡病質的表現還是厭食癥的直接結果，我們給感染了LCMV的小鼠喂食未感染的野生型小鼠，在感染后的兩周內喂食與感染LCMV的小鼠相同數量的食物(成對喂食)。感染后6 - 8天，未感染組體重下降不到初始體重的3%，而感染組體重下降超過10%(圖1a,b)，說明厭食喂養行為不能完全解釋LCMV感染小鼠體重下降的全部程度。

 

      為了描述感染誘導的病理生理學，我們使用代謝籠來監測LCMV感染小鼠與年齡和性別匹配的未感染小鼠的比較。感染后第6天和第8天之間，與未感染的小鼠相比，小鼠表現出嗜睡的跡象，并顯示出食物和水的攝入量、活動和能量消耗減少(圖1b d和補充圖1a)。

 

      由CO2排放與O2消耗比值計算的呼吸交換率(respiratory exchange ratio, RER)在感染后第6天至第8天之間顯著降低(圖1d和補充圖1a)，說明LCMV感染小鼠主要依賴脂肪代謝作為能量底物。這些病理生理變化先于病毒負荷和適應性免疫反應的峰值，后者發生在第8-12天(見補充圖1b-d)。第8天之后，盡管病毒持續存在，小鼠的體重開始緩慢回升(圖1a-c和補充圖1a-d)。

 

圖1 感染LCMV克隆13導致瞬時惡病質。

 

      通過比較身體組分，我們發現，與成對喂養、未感染的小鼠相比，感染后的第一周，脂肪和瘦肉塊(肌肉)均嚴重減少(圖1e,f)。然而，與肌肉相比，脂肪組織在感染后4天內經歷了更早、更嚴重的消耗(圖1f)。隨著時間的推移，這種消耗影響了不同的脂肪庫，包括腹股溝白色脂肪組織、性腺白色脂肪組織和肩胛間棕色脂肪組織(圖1e)。為了評估肌肉質量的損失，我們檢查了股四頭肌、腓腸肌和比目魚肌，它們同時代表慢肌和快肌。感染小鼠的四頭肌和腓腸肌的肌肉質量與成對喂養的小鼠相比有所下降(圖1e)。這與成肌細胞分化標記物MyoD1的表達降低、編碼Atrogin1和Murf1的Fbxo32和Trim63的表達增加有關，與成對喂養的小鼠相比，受感染小鼠的這三種肌肉均參與蛋白酶體降解(見補充圖1e g)。

 

      為了評價病毒接種量與體重減輕之間的關系，我們測定了LCMV克隆13的感染劑量，范圍從2 106 FFU到2 102 FFU。低病毒接種組體重減輕明顯改善;低于2104 FFU的劑量顯示體重幾乎沒有下降(見補充圖1h)。這些較低的病毒接種被認為與加速病毒清除有關。急性LCMV感染與低劑量LCMV克隆13感染的體重動力學相似(見補充圖1i)，提示病毒持久性的決定因素可能與惡病質的發生有關。

 

      為了檢驗營養補充是否能改善體重減輕，我們在感染后第4天至第8天之間，使用口服灌胃給LCMV克隆13只受感染的小鼠每日1千卡的類似于高湯的控制飲食、葡萄糖、橄欖油或酪蛋白。與補充pbs的對照組相比，口服灌胃并沒有減輕體重(圖1i)。相反，與補充pbs的lcmv感染小鼠相比，所有補充灌胃組的恢復速度都較慢(見補充圖1j)，這表明病毒引起的體重下降無法通過營養補充來預防。這些結果揭示了13只LCMV克隆感染小鼠惡病質的幾個特征，包括厭食癥和代謝功能障礙，以及無法通過營養補充逆轉的脂肪和肌肉量減少。

 

      病毒感染引起脂肪組織重塑和脂肪分解。與未感染的對照組相比，LCMV感染小鼠脂肪組織的皮下和內臟室均發生衰竭（圖2a）。通過組織學分析，與未感染小鼠相比，感染LCMV的腹股溝脂肪組織的形態學變化，我們觀察到感染后第6天和第8天脂肪細胞的大小顯著減?。▓D2b，c）。接下來，我們測定了LCMV感染后第0、4、6和8天腹股溝脂肪組織中脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和激素敏感脂肪酶（HSL）的蛋白質豐度和激活狀態，這兩種酶是脂肪溶解的兩個中心酶。與未感染的小鼠相比，LCMV感染期間腹股溝脂肪組織中ATGL和HSL以及磷酸化HSL（PHSL）的表達在Ser660殘基處磷酸化，這表明感染后第6天脂肪分解峰值增加。這與未感染的對照組相比，LCMV感染小鼠血清中非酯化脂肪酸（NEFAs）水平升高（圖2E）證實了這一點。

 

      此外，脂蛋白脂酶（LPL）的減少信使RNA的表達，并在較小程度上降低了腹股溝脂肪中的脂肪清除受體CD36，以及與被喂食的未感染小鼠相比，LCMV感染小鼠血清中甘油三酯水平的升高（圖2E，F），IN。降低脂肪組織中的脂質攝取率和/或肝臟中的脂質動員。Dgat2（甘油三酯生物合成中的限速酶）的mRNA表達下降（圖2f），也表明LCMV感染的MICE15脂質合成率較低。值得注意的是，感染小鼠的腹股溝脂肪墊顯示血管化增加（參見補充圖2b，c），這可能與炎癥介導的組織重塑有關?？傊?，這些數據表明，LCMV克隆13感染通過調節脂質代謝的關鍵調節因子導致脂肪組織中脂質儲存的耗盡。

 

      為了研究病毒誘導的脂肪組織衰竭是否遵循與CAC相似的機制，我們檢測了UCP1的mRNA表達作為脂肪組織老化的指標。感染小鼠的帽間、腹股溝和性腺脂肪中ucp1的mRNA表達比成對喂養小鼠略低（圖2g）。根據Lewis肺癌惡病質模型和ATGL/和HSL/MICE16黑色素瘤模型，ATGL或HSL的缺失足以改善惡病質小鼠的體重減輕，ATGL/的缺失更為深刻，說明ATGL和HSL在CAC中的重要作用。為了確定IAC是否需要這些脂肪酶，我們感染了atgl fl fl adipoqcre/+和hslfl/fl adipoqcre/+小鼠，這些小鼠在脂聯素（adipoqq）啟動子的驅動下有條件地切除脂肪細胞中的atgl和hsl。我們發現，與氟化物對照組相比，兩種脂肪酶的消融術均不能降低LCMV感染期間的體重減輕程度（圖2h），這表明IAC不需要脂肪酶。

 

      激素生長激素釋放肽和脂肪因子（如瘦素和脂聯素）被認為是代謝和免疫過程的活性調節劑。LCMV感染和未感染小鼠血清生長激素釋放肽的數量和腹股溝脂肪組織脂聯素的表達相似（見補充圖2D，F）。值得注意的是，循環中的瘦素水平顯示LCMV感染減少，而第6天腹股溝脂肪組織中瘦素的mRNA表達增加（參見補充圖2e，f），這表明瘦素可能參與了IAC期間脂肪組織的消瘦。然而，瘦素缺乏的lepob/ob小鼠在LCMV感染后體重下降率與lepob/+小鼠相似，并表現出厭食（參見補充圖2g）。我們還量化了lepob/ob和lepob/+小鼠感染后8天內的脂肪和瘦肉量的損失，發現兩組的脂肪和瘦肉室的消耗量相等（參見補充圖2h），這表明，盡管瘦肉素在脂肪組織中的表達量增加了，但它卻降低了小鼠的脂肪和瘦肉量。不介導LCMV感染過程中的活性脂肪溶解狀態或進食行為的中斷。這些結果表明，IAC在感染后第6天到第8天之間觸發脂肪組織的結構和代謝重編程。

 

圖2 |感染相關性惡病質引發嚴重的脂肪組織重塑和脂肪分解增加。

 

      感染相關的惡病質由I型干擾素和CD8+T細胞驅動。在各種惡病質和脂肪組織重塑模型中，細胞因子如IFN-γ、TNF和IL-6觸發體重減輕，獨立或與其他細胞因子和免疫細胞一起發揮作用。對32種細胞因子進行珠子的多重分析，以及IFN-α和IFN-β的ELISA檢測，發現血清細胞因子具有高度動態的模式，并且在野生型LCMV克隆13感染后的第一個96小時內，IFN-γ、TNF、IL-6、IFN-α和IFN-β的誘導。小鼠（圖3a和補充圖2a和補充表1）。參與CAC的細胞因子，如IL-1β和白血病抑制因子8，19，LCMV感染小鼠的血清沒有增加（參見補充圖3A和補充表1）。與促炎細胞因子相關的途徑，如IFN-γ、TNF和IL-6與Cac8,20有關。通過使用ifng/、tnf/和tnfri/小鼠進行基因消融術中和ifn-γ、tnf和il-6，或在感染前1天開始抗體介導的阻斷，然后每2天繼續進行，不能改善LCMV感染小鼠的體重減輕（圖3b，c）。

 

      感染的小鼠，我們同時使用中和抗體去除干擾素-γ和腫瘤壞死因子，在感染后第8天仍然損失高達20%的體重（圖3b）。在感染的前2天內，LCMV感染小鼠血清中檢測到1型IFNs（圖3A）21。與野生型LCMV感染小鼠（圖3d和補充圖3b，c）相比，使用IFNAR1/小鼠對IFN-α/β-受體α鏈（IFNAR）信號的遺傳消融導致感染后8天體重減輕約10%，這表明I型IFN反應與IAC有關。

 

圖31型IFN和CD8 T細胞在誘導感染相關性惡病質中起重要作用。

 

      接下來，我們確定一個特定的T細胞群體是否在LCMV感染期間介導體重減輕。這是通過在LCMV感染（圖3e、f）或CD8/小鼠感染（圖3f）前2天和1天分別靜脈注射CD8+T細胞和CD4+T細胞的消耗性抗體來完成的。在LCMV感染的小鼠中，CD4+T細胞的耗竭不能保護體重減輕（圖3e和補充圖3d f）；但是，與野生型對照組相比，CD8+T細胞的耗竭幾乎沒有導致體重減輕（圖3f和補充圖3d-f）。這些結果提示CD8+T細胞在IAC中起著關鍵作用。

 

      創新點

 

      在這項研究中，為了闡明IAC是炎癥因子，研究人員運用了一個慢性病毒感染模型。IAC在感染后6天出現，在第12天出現適應性免疫反應高峰之前，隨后逐漸消退，與Cac3,5的終末病程相反。在本研究中報道了I型干擾素和CD8+T細胞在觸發IAC中的作用，但不包括IL-6、TNF和IFN-γ，后者是經常介導Cac6,8的細胞因子。IAC的表現除了抗原特異性CD8+T細胞受體啟動外，還需要T細胞而非脂肪細胞內特異性的IFNAR1信號傳導。細胞溶解效應分子穿孔素的缺失或淋巴器官T細胞出口的藥物阻斷均不能阻止惡病質的發生，這提示了除經典的CD8+T細胞介導的細胞毒性以外的其他機制。

 

      本實驗多次運用了ELISA試劑盒進行檢測，其中亞科因生物（Abbkine）的ELIKINE^TM試劑盒作為一個重點檢測指標來使用，即：KET0004檢測小鼠血液中的游離甲狀腺素，使用方法便捷，效果卓越。

 

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