Caspases酶系列2：酶活性檢測試劑盒

      前情回顧：Caspase酶系列1：底物及抑制劑

       上一期給大家介紹了Caspase酶家族及其對應的底物和抑制劑，然后就有小伙伴問小艾：你們有各種Caspase酶活性檢測的試劑盒嗎？小艾不喜歡吹牛，但是還是想說那句話：你想要的我們都有。今天就給同學們介紹幾款Caspase酶的活性檢測試劑盒：

 

        1. 基于活細胞Caspase酶活性檢測：

 

      Cell Meter™ Caspases酶活性測定試劑盒提供了一種強大而便捷的方法來測量活細胞中的Caspases酶活性。這些測定法利用含有識別位點的可滲透細胞的底物來測量Caspases 3和7，Caspases 8或Caspases 9的活性，以及可以同時測量四種Caspases的多重檢測試劑盒。

 

      Cell Meter™ Caspases酶活性測定試劑盒檢測原理：Caspases識別序列的結合抑制了熒光團或生色團產生可量化信號的能力。在適當的活化的Caspases酶的存在下，將熒光團或發色團從識別序列上切割下來，并自由地產生指示凋亡的明亮的熒光或顏色信號。該測定對于其各自的活化的胱天蛋白酶高度特異性的。檢測過程無需清洗的步驟，Cell Meter™半胱天冬酶活性測定試劑盒可輕松應用于高通量篩選。

 

 

      圖1. Jurkat細胞中Caspase活性的檢測。當天將Jurkat細胞以200,000個細胞/孔的密度接種在96孔板中。用星形孢菌素以1mM的終濃度處理細胞4小時（紅色），而未處理的細胞用作對照（藍色）。加入單半胱天冬酶測定上樣溶液（100 µL /孔）（對于Caspase 3/7，在＃1中；對于Caspase 8在＃2中；對于Caspase 9，在＃3中）；或三重半胱天冬酶測定上樣溶液（對于caspase 3，＃4一起添加/ 7、8和9），并在室溫下孵育1小時。使用FlexStation熒光酶標儀在指定波長下測量熒光強度。Caspase 3 / 7、8和9的活性可以在一次測定中檢測到，而不受其他Caspase的干擾。

 

       用于測定活細胞種Caspases 3、7、8和9活性的試劑盒：

 

 

       2. 基于溶液的Caspase 3/7活性檢測

 

      Amplite™Caspase 3/7活性測定試劑盒提供了一種簡單而強大的方法來測量細胞提取物和純化的酶制劑中的caspase 3和7。該測定使用含有對Caspase 3/7具有特異性的DEVD識別序列的底物。DEVD識別序列與熒光結合導致所連接的熒光團或發色團不發光。在Caspase 3/7的存在下，熒光團或發色團從DEVD序列上切割下來，并自由產生明亮的熒光或表示凋亡的彩色信號。

 

       熒光法Caspase 3/7活性測定試劑盒組分包括：

 

      Caspase 3/7底物（200X儲備溶液）

      Caspase 3/7抑制劑

      分析緩沖液

      DTT（還原劑）

 

 

      圖2.使用Amplite™熒光Caspase 3/7分析試劑盒檢測Jurkat細胞中Caspase 3/7活性。當天，將Jurkat細胞以80,000個細胞/孔/ 90 µL的濃度接種在96孔板中。用/不用20 µM喜樹堿處理細胞5小時，用/不用5 µM的Caspase 酶抑制劑AC-DEVD-CHO處理細胞10分鐘。加入Caspase 3/7測定溶液（100μL/孔），并在室溫下孵育1小時。在Ex / Em ＝ 350 / 450nm下測量熒光強度。

 

       用于測定溶液樣本的Caspases 3/7活性的試劑盒：

 

       3. Caspase酶結合檢測

 

      在凋亡過程中，關鍵事件之一是Caspase酶的激活，這對于凋亡的啟動很重要。Cell Meter™活細胞Caspase酶結合試劑盒使用可透過細胞且無毒的熒光指示劑來檢測caspase 1、2、3 / 7、6、8、9、10和13的活性。一旦與Caspase酶結合，熒光試劑就保留在細胞內。結合事件阻止了胱天蛋白酶的進一步催化反應，但不會阻止凋亡的進行。Caspase結合試劑盒適用于熒光顯微鏡，流式細胞儀和熒光酶標儀。該試劑盒提供所有必需成分，并具有優化的測定方案，

 

       半胱天冬酶結合測定試劑盒包括：

 

      熒光Caspase抑制劑

      500X Hoechst（活細胞DNA染色）

      500X碘化丙啶或500X Nuclear Grean™DCS1（壞死細胞染色）

      洗滌緩沖液

 

 

      圖3.在Jurkat細胞中使用FAM-DEVD-FMK（貨號: 20100）進行熒光檢測活性Caspase 3/7。細胞用1 µM星形孢菌素處理4小時（紅色），而未處理的細胞用作對照（綠色）。將對照和處理過的細胞與FAM-DEVD-FMK在37°C下孵育1小時，然后在染色后洗滌一次。熒光強度用NovoCyte™3000流式細胞儀FITC通道測量。

 

       用于測定Caspase 1、2、3 / 7、6、8、9、10或13活性的結合檢測試劑盒：

 

 

       4. Caspase酶和磷脂酰絲氨酸（PS）多重測定

 

      Cell Meter™活細胞Caspase 3/7和磷脂酰絲氨酸檢測試劑盒旨在通過同時監測哺乳動物細胞中的Caspase 3/7和Annexin V活性來檢測凋亡。Annexin V是在鈣存在下與磷脂膜結合的蛋白質家族。Annexin V可用于檢測在細胞表面表達磷脂酰絲氨酸（PS）的凋亡細胞，PS在細胞表面上的出現是細胞凋亡的初始/中間階段的普遍指標。Annexin V-dye綴合物通過測量PS的轉運來監測細胞凋亡。該試劑盒還提供了一種Hoechst染料，用于標記整個細胞群體的細胞核，以及碘化丙啶染料，用于對壞死細胞進行染色。

 

 

      圖4. 熒光圖像分析表明，由1 µM星形孢菌素誘導的Jurkat細胞中Caspase 3/7（紅色，由TF3-DEVD-FMK染色）和Annexin V（綠色，由膜聯蛋白V-iFluor 488™染色）的表達增加。 3個小時。用奧林巴斯熒光顯微鏡分別通過DAPI，FITC和TRITC通道拍攝細胞的熒光圖像（300,000個細胞/孔）。如上所示，合并了從同一細胞群體的每個通道拍攝的單個圖像。A：非誘導的對照細胞；B：星形孢菌素誘導的細胞對Caspase 3/7（紅色）和Annexin V（綠色）的雙重染色；C：星形孢菌素誘導的細胞對Caspase 3/7（紅色），Annexin V（綠色）和核（藍色）的三重染色。

 

      用于測量細胞凋亡的胱天蛋白酶和磷脂酰絲氨酸檢測試劑盒：

 

 

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