不同類型抗體儲存時注意要避免污染或損失請每次均查看抗體說明書是否有特殊的保存要求。Abcam 公司對于非正確保存的抗體不保證其有效。對于保存適當的抗體,大多數的活性保持時間為數個月甚至數年。
8% 多聚甲醛溶液配制時應60°C 加熱攪拌(溫度不要超過60°C)。溶液達到60°C 時多聚甲醛溶解,加入500ml 0.2mM 磷酸鹽緩沖液,使0.1mM 磷酸鹽緩沖液中含4% 多聚甲醛。小心滴加1 當量的氫氧化鈉溶液直至溶液澄清(每500ml 滴加1 至2 滴;如果仍未澄清,可繼續滴加?;蛘?,可在1 至2L 溶液中加入2 粒固體氫氧化鈉)。溶液變冷后過濾。
三乙醇胺-吐溫緩沖液(含0.1% 的吐溫20)
配制1L 溶液:取100ml 10 倍三乙醇胺緩沖液加890ml 超純水,再加入10ml 吐溫20 (10%)吐溫20 很粘稠會粘在量取的槍頭上,要確定加入三乙醇胺緩沖液的變性劑體積足夠。建議使用10% 的溶液進行配制,會比用未稀釋的吐溫20 溶液容易配制。
無特異性抗體對照時出現背景過高與蛋白A 或G 非特異性結合應采用預清除處理,即在加入抗體前,將裂解的樣本與磁珠混合1小時然后分離使用。
染色質免疫共沉淀是一種強力的手段,來聯系蛋白質或其修飾位點與基因組的關系。染色質分離并用特異性抗體判斷是否與特異性DNA 序列相結合。染色質免疫沉淀法亦可用來檢測目的位點在基因組中的時空分布(用芯片或DNA 測序)。本操作規程詳細闡述了交聯染色質免疫沉淀(X-ChIP) 實驗的具體步驟。
此方法涉及抗IgM 抗體的IgG 耦聯蛋白A 或G 珠子(方法見下文)。這些珠子就可以在常規免疫共沉淀程序中使用IgM 抗體。通過結合抗-IgM 抗體,IgM 可以間接結合珠子。
為了使洗脫蛋白較少污染抗體,也為了更純凈蛋白質的制備和干凈的免疫印跡實驗,推薦將抗體與珠子交聯。下面是一個實驗程序舉例(幾個網站有關于這個程序有很多信息)。目標蛋白應該用溫和的洗脫液洗脫,如甘氨酸緩沖液。
為了使洗脫蛋白較少污染抗體,也為了更純凈蛋白質的制備和干凈的免疫印跡實驗,推薦將抗體與珠子交聯。下面是一個實驗程序舉例(幾個網站有關于這個程序有很多信息)。目標蛋白應該用溫和的洗脫液洗脫,如甘氨酸緩沖液。更詳細的緩沖液配方可在緩沖液章節找到,第71頁。
裂解物預清除可以幫助減少蛋白質非特異性結合到agarose (瓊脂糖)或Sepharose beads (凝膠瓊脂糖珠)。用無關抗體或血清預清除,可去除蛋白質與免疫球蛋白的非特異結合。最終實驗結果背景降低并且信噪比提高。但是,如果最后蛋白質是由免疫印跡實驗檢測,預清除未必必要,除非是污染蛋白質對目的蛋白質產生明顯干擾。
免疫沉淀是一種純化蛋白質的方法。將我們感興趣的一種蛋白質的抗體與細胞提取液孵育,以使抗體和蛋白質在溶液中結合。然后用蛋白A/G 耦合的瓊脂糖凝膠,從樣品中將抗體/抗原復合物提取出來。這種物理方法可將所需蛋白質從樣品中分離出來。然后樣品可以通過SDS-PAGE 分離出來進行Western blot 分析。
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